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【qPCR】熒光定量PCR的熔解曲線,你了解多少?

熔解曲線探針?lè)?/strong>是一種利用特異性探針結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上的技術(shù),通過(guò)監(jiān)測(cè)探針與目標(biāo)DNA結(jié)合狀態(tài)的溫度依賴性變化,來(lái)識(shí)別和定量特定的DNA或RNA序列。

這種方法的關(guān)鍵在于探針與目標(biāo)序列完全匹配時(shí),其熔解溫度(Tm值)較高;而存在單核苷酸多態(tài)性(SNPs)或其他變異時(shí),Tm值會(huì)下降。通過(guò)比較不同樣本的熔解曲線,可以精確地識(shí)別序列差異。

一、基本原理

熔解曲線探針?lè)ǖ脑?/strong>

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)雙鏈DNA受熱時(shí),其互補(bǔ)堿基之間的氫鍵逐漸斷裂,導(dǎo)致雙鏈分離成兩條單鏈,這一過(guò)程被稱為DNA的“熔解”。隨著溫度的升高,DNA的熒光強(qiáng)度會(huì)發(fā)生變化,通過(guò)監(jiān)測(cè)這種變化,可以繪制出DNA的熔解曲線。探針?lè)ㄈ劢馇€分析利用特異性探針結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上,通過(guò)對(duì)探針與目標(biāo)DNA結(jié)合狀態(tài)的溫度依賴性檢測(cè),來(lái)識(shí)別和定量特定的DNA或RNA序列。

二、關(guān)鍵技術(shù)

01熒光探針

TaqMan探針:基于水解作用釋放熒光,用于實(shí)時(shí)定量PCR。

分子信標(biāo):莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合目標(biāo)后熒光恢復(fù),特異性高。

蝎形探針:整合引物與探針功能,可多靶點(diǎn)檢測(cè)。

雙雜交探針:依賴熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè)。

構(gòu)成:探針通常由三部分組成

(1)熒光基團(tuán):如FAM、VIC等,用于發(fā)射熒光信號(hào)。

(2)淬滅基團(tuán):如TAMRA、BHQ等,用于淬滅熒光信號(hào)。

(3)特異性序列:與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)結(jié)合。

作用機(jī)制:探針與目標(biāo)序列結(jié)合時(shí),熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離,釋放熒光信號(hào);當(dāng)探針與目標(biāo)序列解離時(shí),熒光信號(hào)減弱或消失。

02PCR擴(kuò)增

引物設(shè)計(jì):設(shè)計(jì)特異性引物,確保目標(biāo)序列的高效擴(kuò)增。

探針加入:在PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化。

03熔解曲線分析

溫度梯度:PCR完成后,逐步升溫(通常從60°C升至95°C),使DNA雙鏈和探針-目標(biāo)復(fù)合物解離。

熒光監(jiān)測(cè):實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化,記錄熒光強(qiáng)度隨溫度的變化曲線。

Tm值:探針與目標(biāo)序列的解離溫度(Tm)取決于序列的匹配程度,完全匹配與錯(cuò)配的Tm值不同。

三、技術(shù)流程

探針設(shè)計(jì):設(shè)計(jì)特異性探針,確保其與目標(biāo)序列完全匹配。

PCR擴(kuò)增:將探針、引物、模板DNA和熒光染料加入反應(yīng)體系,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

熔解曲線分析:PCR完成后,逐步升溫,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化。

數(shù)據(jù)分析:根據(jù)熔解曲線的峰值(Tm值)判斷目標(biāo)序列的特性。

四、技術(shù)特點(diǎn)

特異性高:探針?lè)ㄈ劢馇€分析利用特異性探針結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上,通過(guò)監(jiān)測(cè)探針與目標(biāo)DNA結(jié)合狀態(tài)的溫度依賴性變化,能夠精確識(shí)別和定量特定的DNA或RNA序列。當(dāng)探針與目標(biāo)序列完全匹配時(shí),熔解溫度(Tm值)較高;如果存在單核苷酸多態(tài)性(SNPs)或其他變異,Tm值會(huì)下降,從而可以精確識(shí)別序列差異。

靈敏度高:探針?lè)ㄈ劢馇€技術(shù)能夠檢測(cè)到非常低的DNA濃度變化,適用于微量樣本的檢測(cè)。通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)序列的靈敏檢測(cè)。

操作簡(jiǎn)便:相比其他分子生物學(xué)技術(shù),探針?lè)ㄈ劢馇€技術(shù)的操作相對(duì)簡(jiǎn)便。實(shí)驗(yàn)者只需在PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行DNA雙鏈產(chǎn)物升溫解鏈反應(yīng),監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化即可繪制出熔解曲線。

應(yīng)用廣泛:該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因分型、SNP檢測(cè)、病原體鑒定等領(lǐng)域。通過(guò)比較不同樣本的熔解曲線,可以精確地識(shí)別出序列差異,為遺傳學(xué)研究和臨床診斷提供重要依據(jù)。

峰型倒置現(xiàn)象:在探針?lè)ㄈ劢馇€中,有時(shí)會(huì)出現(xiàn)峰型倒置現(xiàn)象,即在某個(gè)溫度點(diǎn)后熒光信號(hào)反而增強(qiáng)。這種現(xiàn)象可能是由于探針解離動(dòng)力學(xué)、非特異性產(chǎn)物、引物二聚體、探針設(shè)計(jì)問(wèn)題或熒光染料特性等因素引起的。雖然這種現(xiàn)象可能指示實(shí)驗(yàn)中的非特異性事件,但也可以通過(guò)合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件來(lái)避免或解釋這種現(xiàn)象。

五、應(yīng)用領(lǐng)域

基因分型:用于檢測(cè)SNP、插入/缺失等遺傳變異。

突變檢測(cè):識(shí)別點(diǎn)突變、基因重排等。

病原體鑒定:快速檢測(cè)病毒、細(xì)菌等病原體的特異性序列。

腫瘤標(biāo)志物檢測(cè):用于腫瘤相關(guān)基因突變的篩查。

藥物基因組學(xué):研究藥物代謝相關(guān)基因的多態(tài)性。

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