一個(gè)成熟、穩(wěn)定的PCR反應(yīng)成形之前必會經(jīng)歷許多的坎坷，優(yōu)質(zhì)模板的獲取、高特異性引物的設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系各組分的優(yōu)化、反應(yīng)程序的優(yōu)化等等。今天我們來聊聊反應(yīng)程序優(yōu)化的那些事兒。

首先，優(yōu)質(zhì)的模板是PCR成敗的前提，沒有優(yōu)質(zhì)的模板后續(xù)工作做得再好也是巧婦難為無米之炊。優(yōu)質(zhì)的模板除了濃度和純度外，模板的完整性也是一個(gè)關(guān)鍵因素。不能僅以純度（260/280、260/230的比值）來衡量模板的優(yōu)劣，一定要跑個(gè)膠確認(rèn)下。

例如石蠟切片核酸的提取，即使比值堪稱完美，沒有膠圖參考的情況下也不建議直接進(jìn)行后續(xù)的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，因?yàn)闃O易翻車。解交聯(lián)后核酸會片段化，一不注意都碎成了幾十bp的長度……那之前檢測的濃度和純度就成了擺設(shè)，一點(diǎn)意義也無。

再說引物的特異性，這方面常見的是去NCBI檢索現(xiàn)成的引物或者依靠引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)。將設(shè)計(jì)好的引物序列去基因庫比對一下，沒有重合就可以找合成公司去合成了（常用Primer 5設(shè)計(jì)引物，Oligo 7對引物進(jìn)行評價(jià)。評分高的引物特異性高、引物二聚體的概率也低）。

反應(yīng)體系優(yōu)化這里簡單介紹一下鎂離子濃度的優(yōu)化。dNTP可以結(jié)合鎂離子，被結(jié)合的鎂離子無法維持Taq酶的活性，所以鎂離子的摩爾濃度一定要比dNTP的總濃度要高。但是過高的鎂離子濃度又會增加Taq酶的錯(cuò)配率，所以鎂離子的濃度是關(guān)乎擴(kuò)增效果的一個(gè)重要參數(shù)。

反應(yīng)程序則多集中于優(yōu)化退火溫度。退火溫度常設(shè)置在引物對的Tm值附近，若想得到較高的保真率，退火溫度就略高于Tm值；若想得到較高的產(chǎn)物，退火溫度就略低于Tm值。教材中常用的55℃退火72℃延伸，便是因?yàn)?5℃處于大多引物的Tm值附近（或略低），這一設(shè)定也許不是最適的退火溫度但一般能擴(kuò)增出產(chǎn)物（72℃是Taq酶最適溫度）。

最后聊一下反應(yīng)程序優(yōu)化中經(jīng)常被忽略的一個(gè)環(huán)節(jié)-變溫速率。變溫速率，尤其是變性-退火這一環(huán)節(jié)的變溫速率尤其重要。相對緩慢的變溫速率，有助于堿基嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行反應(yīng)，這一點(diǎn)不論是從HRM實(shí)驗(yàn)中非沃森-克里克結(jié)構(gòu)的形成及消除還是DNA oligo的退火實(shí)驗(yàn)都有體現(xiàn)，甚至可以說是極端體現(xiàn)。當(dāng)我們實(shí)驗(yàn)時(shí)遇到了熔解曲線主峰前有雜峰、測序結(jié)果套峰等不良結(jié)果時(shí)不妨把退火的降溫速率下調(diào)一些，緩一緩，或許能看到另一番風(fēng)景。

最后的最后分享兩張圖：模板，反應(yīng)程序、反應(yīng)體系一致，只調(diào)試了退火降溫速率。

圖1：變溫速率2℃/sec

圖2：變溫速率4℃/sec