下面小編就來分享一下自己當(dāng)初的一些經(jīng)驗(yàn)心得，僅代表個(gè)人看法。

先說體系配置（各組分分開，非預(yù)混液）。配置前先計(jì)算好所需要的各組分體積，統(tǒng)一配置好后再進(jìn)行分裝。有的同學(xué)可能會(huì)心疼試劑，獨(dú)愛單孔配置方式……但對(duì)于實(shí)驗(yàn)來說，一次即可順利獲取有效結(jié)果才是最大的節(jié)約。在體系的配置時(shí)需注意一下各組分的添加順序：先加ddH₂O,其余組分再按體積大小依次加入。排液時(shí)，吸頭扎入液面以下排液，排出液體后嚴(yán)禁原處反復(fù)吸打潤洗槍頭（引物、酶、模板尤其需要注意）。吸頭有一定的吸附性，液體被排出后，如在原處潤洗組分會(huì)被反吸回吸頭，經(jīng)過三五次的潤洗可能會(huì)使目標(biāo)組分有嚴(yán)重的損失。如果想將吸頭內(nèi)的組分充分轉(zhuǎn)移，換個(gè)位置去潤洗吸頭。體系混勻也需注意，可以用合適量程的移液器緩慢吹打5-10次，也可以緩慢上下顛倒混勻；如果需要用斡旋振蕩器混勻的話，轉(zhuǎn)速盡量控制在600rpm以下，轉(zhuǎn)速過快的話對(duì)酶的損傷較大，低拷貝模板的曲線是否起跳差異會(huì)比較明顯。體系分裝到pcr反應(yīng)管時(shí)，移液器保持“吸一打一”的操作，不易生成氣泡。

再說實(shí)驗(yàn)環(huán)境。老生常談的要在超凈工作臺(tái)內(nèi)配置反應(yīng)體系，生物安全柜內(nèi)添加模板。超凈臺(tái)內(nèi)，按照常規(guī)操作不會(huì)有太大問題；生物安全柜可是氣溶膠污染的重災(zāi)區(qū)。生物安全柜內(nèi)氣溶膠主要來源于加樣后的棄吸頭，生物安全柜內(nèi)以循環(huán)風(fēng)為主，棄吸頭內(nèi)的殘留模板很容易會(huì)隨循環(huán)風(fēng)彌漫整個(gè)安全柜的內(nèi)環(huán)境，所以每次實(shí)驗(yàn)完都需要及時(shí)把棄吸頭打包好取出安全柜。尤其遇到中午沒有完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)下午還要繼續(xù)爆肝的情況，一定要把垃圾桶內(nèi)的棄槍頭清理干凈，如果沒有人使用的話就擦拭后進(jìn)行紫外照射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的臺(tái)面清理及紫外消殺均屬基操，但需切實(shí)落實(shí)到位。

最后分享一下復(fù)孔實(shí)驗(yàn)如何操作可以提高曲線的成束性。配置反應(yīng)復(fù)孔時(shí)，可以參照統(tǒng)一配置體系的操作，將所有反應(yīng)孔的模板和體系混和好再逐孔分裝。這樣可以有效降低跳孔的風(fēng)險(xiǎn)。如果是低拷貝擴(kuò)增（Ct值33以后曲線起跳），就不推薦模板混入反應(yīng)體系再分裝了，此時(shí)還是老老實(shí)實(shí)的逐孔加入模板更為穩(wěn)妥（泊松分布影響明顯）。

此時(shí)是不是覺得自己強(qiáng)的可怕，迫不及待的想要實(shí)驗(yàn)一把？先別急，工欲善其事，必先利其器。柏恒科技專注PCR儀16年，可為您提供各類梯度PCR儀及qPCR儀，助力您的研究！

一.儀器外部清潔    

1.用潔凈毛巾或紙巾擦拭整機(jī)的外殼，將儀器挪開原先的位置，清理儀器下面的桌面的灰塵及細(xì)小的雜物，以免桌面上積攢過多導(dǎo)致污染頻出 。

2.檢查儀器進(jìn)風(fēng)口以及出風(fēng)口是有遮擋或灰塵積攢，以免通風(fēng)口被灰塵、纖維等雜物堵塞而造成散熱不好，從而影響儀器升降溫速度和溫控精準(zhǔn)度，造成實(shí)驗(yàn)效果不理想。    

3.儀器周圍需要留出20-30厘米空間以保證良好的通風(fēng)散熱，具體要求可參見儀器說明書。?

二.樣品槽清潔    

1.檢查PCR儀樣品槽是否潔凈如有污染，可用蘸有75%的棉簽擦拭樣品孔，再在25℃下運(yùn)行2-5min，以蒸干槽內(nèi)的酒精溶液。定期清潔樣品槽，建議半年1次。    

2.若是定量PCR儀，樣品孔中若被帶有熒光染料的樣品溶液污染，會(huì)影響實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果，所以更需要保證樣品槽的潔凈，建議2-3個(gè)月一次。 ? ?

三.熱蓋清潔    

1.檢查熱蓋是否左右晃動(dòng),熱蓋能夠卡緊扣好，以保證程序運(yùn)行過程中樣品沒有蒸發(fā)現(xiàn)象。    

2.PCR管蓋上的記號(hào)筆標(biāo)記容易在熱蓋上留下印漬，可定期用蘸有75%酒精的柔軟潔凈布進(jìn)行擦拭，并將熱蓋升溫至99℃保溫3-5min，以去除酒精殘留。    

四.測(cè)溫    

1.樣品槽溫度的均一性和準(zhǔn)確性關(guān)乎實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞，建議聯(lián)系廠家或售后由專業(yè)的售后工程師定期對(duì)儀器進(jìn)行溫度測(cè)定及校準(zhǔn)，以保證儀器溫控性能正常（尤其是使用3年以上的儀器）。    

2.熒光定量pcr儀使用注意事項(xiàng) ? ?

避免腐蝕性液體接觸樣品槽，以免樣品槽表面被腐蝕，造成樣品加熱不均勻。    

3.避免PCR儀與冰箱等大功率儀器共用一個(gè)電源接口，大功率儀器的電流波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致PCR儀的運(yùn)行不穩(wěn)定，甚至重啟。若是定量PCR儀，會(huì)影響收集到的熒光信號(hào)強(qiáng)度，造成擴(kuò)增曲線的波動(dòng)。    

4.儀器在運(yùn)行過程中，禁止強(qiáng)行切斷電源來結(jié)束程序（突遇停電等意外除外），因?yàn)殡娫辞袛嗪螅L(fēng)扇強(qiáng)制停止，導(dǎo)致儀器內(nèi)部元器件散熱不順暢，影響元器件使用壽命。    

5.如果發(fā)現(xiàn)儀器降溫速度明顯比正常狀態(tài)的慢，儀器發(fā)燙，或者溫度下降達(dá)不到設(shè)定的溫度，請(qǐng)檢查進(jìn)風(fēng)口和出風(fēng)口是否有異物堵塞。    

6.若采用PCR單管做實(shí)驗(yàn)而且樣品量比較少時(shí)，為保證熱蓋平整壓在所有樣品管上，建議在樣品槽四個(gè)角放置4個(gè)同類型的空管。    

7. PCR反應(yīng)最后低溫保存請(qǐng)?jiān)O(shè)置為：16℃， （切忌4℃長時(shí)間保存，避免儀器過度耗損）。

*使用前預(yù)熱

儀器使用前需要進(jìn)行預(yù)熱，不僅對(duì)儀器維護(hù)有好處，還能節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。儀器升溫快，但還是建議最好能在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前預(yù)熱2min，這樣可以有效延長儀器的使用壽命。

*定期運(yùn)行維護(hù)

PCR儀器使用頻率較低的情況下，需要在儀器關(guān)閉1小時(shí)后用軟布或塑料紙覆蓋以防止灰塵進(jìn)入。儀器如果長期不使用，需要至少每隔半個(gè)月進(jìn)行一次開機(jī)自檢，運(yùn)行20min左右。

這個(gè)九月
當(dāng)校園里飄起桂花香
當(dāng)實(shí)驗(yàn)室響起儀器輕鳴
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引言

PCR是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)之一，常做實(shí)驗(yàn)的同學(xué)或許認(rèn)為非常簡單，但對(duì)新人來說其實(shí)并不是那么友好。今天小編來分享下曾經(jīng)踩過的那些坑（血淚史）……

首先，優(yōu)質(zhì)的模板是成功反應(yīng)的前提。優(yōu)質(zhì)的模板需滿足以下幾點(diǎn)：高純度、足夠的長度、適宜的濃度。核酸純度可以用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)的兩個(gè)比值來衡量（260/280和260/230）。當(dāng)然超微量也可以檢測(cè)核酸的濃度，但不能有效反應(yīng)核酸的長度。常見的動(dòng)物血液、組織、或者植物組織用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)濃度沒有問題，但石蠟包埋樣本或者石蠟切片樣本檢測(cè)就需慎重，使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)純度的同時(shí)需要輔助其他手段驗(yàn)證其濃度是否準(zhǔn)確，比如跑膠看一下是否有明亮光影區(qū)（包埋樣本提取的核酸在所需長度附近有明亮的片狀光影就OK了，基本沒有條帶一說）或者用染料法（Qubit）復(fù)測(cè)一下。最后再說一下適宜的濃度，擴(kuò)增試劑說明書中規(guī)定模板添加體積的同時(shí)大多也會(huì)說明投入核酸的總量，這時(shí)就需要根據(jù)核酸的濃度進(jìn)行簡單的計(jì)算，不足的體積用水補(bǔ)足，投入反應(yīng)的核酸過多反而會(huì)導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加。如果提取的核酸濃度過低，就只能適當(dāng)?shù)臄U(kuò)大添加體積，不過要適量，擴(kuò)大反應(yīng)體積的同時(shí)也意味著dNTPs、酶、引物等濃度的下降，進(jìn)而影響擴(kuò)增體系的性能。

柏恒科技超微量分光光度計(jì)在檢測(cè)核酸濃度、純度的基礎(chǔ)上還整合了染料法檢測(cè)功能，讓您的核酸質(zhì)控?zé)o憂

其次，搭配合理的反應(yīng)體系是成功反應(yīng)的保障。PCR反應(yīng)的五要素，除了模板其余四項(xiàng)都能歸入反應(yīng)體系的范疇。常規(guī)的PCR實(shí)驗(yàn)中，引物的濃度相對(duì)固定，所以只要找市場(chǎng)上口碑不差的合成公司來合成基本不會(huì)有什么問題。需要注意的是，引物如果溶了應(yīng)立即分裝凍存，最小分裝量根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)所需體積自行確定。切忌引物溶解后不進(jìn)行分裝，整管凍存，反復(fù)凍融個(gè)三五次后效果就會(huì)下降不少。鎂離子、DNA聚合酶、dNTPs三者的相關(guān)性較高。dNTPs會(huì)結(jié)合鎂離子，被結(jié)合的鎂離子就無法再和DNA聚合酶結(jié)合，無法激活DNA聚合酶的活性。所以鎂離子的摩爾濃度一定要大于dNTPs的總濃度，但過高濃度的鎂離子在提高酶活和產(chǎn)物量的同時(shí)也提高了PCR反應(yīng)的錯(cuò)配率。所以如果PCR反應(yīng)結(jié)束后需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序研究就不推薦較高的鎂離子濃度。dNTPs也是類似，較高濃度有助于獲得更多的擴(kuò)增產(chǎn)物，但也會(huì)提高反應(yīng)的錯(cuò)配率。至于聚合酶，現(xiàn)在市場(chǎng)化的商品更青睞于混酶（高保真酶和Taq酶混合）既兼顧擴(kuò)增反應(yīng)的保真又保證了最終產(chǎn)物的得率。概括下來，PCR的反應(yīng)產(chǎn)物若是需要進(jìn)行測(cè)序研究就推薦相對(duì)低濃度鎂離子、dNTPs的反應(yīng)體系，讓堿基序列高度保真；若是僅看擴(kuò)增曲線或者產(chǎn)物條帶的話就推薦較高濃度的鎂離子、dNTPs的反應(yīng)體系，保證有更多/高的產(chǎn)物、信號(hào)。注：PCR反應(yīng)本身存在極低的錯(cuò)配率，對(duì)于分析產(chǎn)物的條帶大小或者qPCR的熒光信號(hào)分析不會(huì)有影響。但若進(jìn)行測(cè)序分析就需要考慮將錯(cuò)配率降至不影響測(cè)序結(jié)果的水平。

最后，相匹配的反應(yīng)程序是成功反應(yīng)的橋梁。模板在一次次的升降溫循環(huán)中完成自身的復(fù)制過程。常見的95℃變性、55℃退火、72℃延伸適用于大多數(shù)反應(yīng)，可以得到所需的目標(biāo)產(chǎn)物。但具體到某一實(shí)驗(yàn)時(shí)，還需根據(jù)引物的Tm值對(duì)反應(yīng)的溫度進(jìn)行微調(diào)，降低非特異擴(kuò)增、增加目標(biāo)產(chǎn)物，以期達(dá)到最佳的反應(yīng)效果。

柏恒科技PCR儀助力您快速確定匹配的反應(yīng)程序

2025“年中奮進(jìn)之旅”

—【蓄勢(shì)篇】—

七月的杭州熱情似火

柏恒人以更加熾熱的激情

開啟了2025年中奮進(jìn)之旅！

在這四天里

我們以數(shù)據(jù)丈量成長

用戰(zhàn)略謀劃未來

憑實(shí)力加冕榮耀！

現(xiàn)在

讓我們一同回顧這段濃縮智慧的精彩時(shí)光！

市場(chǎng)戰(zhàn)略雙日談 Day 1-2

1  市場(chǎng)部年中復(fù)盤

市場(chǎng)部率先打響年中第一槍！通過深度復(fù)盤上半年市場(chǎng)表現(xiàn)，精準(zhǔn)把脈行業(yè)趨勢(shì)，制定了下半年戰(zhàn)略。

2  市場(chǎng)部與研發(fā)部的碰撞

在年中跨部門頭腦風(fēng)暴中，市場(chǎng)部與研發(fā)部的這場(chǎng)關(guān)于產(chǎn)品優(yōu)化及定位的辯論，意外成為最富啟發(fā)性的思想交鋒。

“當(dāng)市場(chǎng)敏銳度遇上技術(shù)創(chuàng)造力，火花就是這么耀眼！”

管理層戰(zhàn)略攻堅(jiān)/銷售精英培訓(xùn) Day 3

部門年中匯報(bào)

核心管理層8小時(shí)高強(qiáng)度閉門會(huì)議：

2025年中管理層會(huì)議系統(tǒng)總結(jié)了公司在技術(shù)創(chuàng)新、市場(chǎng)布局、運(yùn)營優(yōu)化和人才建設(shè)等方面取得的突破性進(jìn)展，同時(shí)明確了下半年戰(zhàn)略目標(biāo)。

在思考的深度決定發(fā)展的高度。

銷售精英培訓(xùn)

為打造一支”懂技術(shù)、精業(yè)務(wù)、善服務(wù)”的銷售狼軍，開展了產(chǎn)品特訓(xùn)，來自全國各區(qū)域的銷售精英們?nèi)A麗蛻變！

最好的銷售是能用工程師思維講產(chǎn)品，用客戶語言說價(jià)值。

2025下半場(chǎng)，市場(chǎng)部已準(zhǔn)備好打一場(chǎng)漂亮的升級(jí)戰(zhàn)！

北高峰登頂行動(dòng)/年中盛典 Day4

【巔峰一日】

第四天的柏恒年中盛典

將”腳踏實(shí)地”與”年中盛典”完美融合！

從北高峰的晨曦到頒獎(jiǎng)臺(tái)的星光，

這一天注定載入柏恒史冊(cè)！

NO.1?晨光篇：北高峰登頂行動(dòng)

“勇攀高峰，再創(chuàng)巔峰”

銷售狼軍：
早晨7:00集結(jié)，登上天下第一財(cái)神廟
財(cái)神廟前許下”業(yè)績長虹”的虔誠心愿

“每登一級(jí)臺(tái)階，都是向年度目標(biāo)邁進(jìn)的一步！”

拜完財(cái)神，信心滿滿！  

柏恒銷售部，下半年繼續(xù)加油，  

讓業(yè)績和好運(yùn)一起‘噌噌’往上沖！

NO.2?午學(xué)篇：全員能力升級(jí)

在年中盛會(huì)之際，我們特別為全體員工打造了一場(chǎng)干貨滿滿的產(chǎn)品知識(shí)”充電站”！這場(chǎng)培訓(xùn)不僅是對(duì)公司產(chǎn)品線的系統(tǒng)梳理，更是對(duì)”以客戶為中心”理念的深度踐行。

質(zhì)量月活動(dòng)：

“質(zhì)量知識(shí)擂臺(tái)賽”上，來自各部門的代表展開了一場(chǎng)別開生面的智慧較量！這場(chǎng)競(jìng)賽不僅檢驗(yàn)了員工對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的掌握程度，更生動(dòng)詮釋了”質(zhì)量就是企業(yè)生命線”的深刻內(nèi)涵。

這場(chǎng)別開生面的知識(shí)競(jìng)賽，用輕松有趣的方式達(dá)成了嚴(yán)肅的質(zhì)量教育目標(biāo)，為”柏質(zhì)·同心”質(zhì)量月活動(dòng)又新增了一亮點(diǎn)。現(xiàn)在，帶著這份對(duì)質(zhì)量的深刻認(rèn)知，全體柏恒人已整裝待發(fā)，向著”零缺陷”的目標(biāo)繼續(xù)前進(jìn)！

NO.3?戰(zhàn)略篇：領(lǐng)導(dǎo)力時(shí)刻

全體會(huì)議上：
黃總年中總結(jié)發(fā)言：從銷售突破到生產(chǎn)交付，從產(chǎn)品升級(jí)到流程優(yōu)化——我們用數(shù)據(jù)總結(jié)成長，用問題指明方向。

但比成績更重要的，是共識(shí)的力量：唯有目標(biāo)同頻、思想同步，才能讓‘各自優(yōu)秀’凝聚成‘團(tuán)隊(duì)卓越’！

NO.4?榮耀篇：年中優(yōu)秀員工表彰

2025上半程的精彩，由每一位拼搏者共同書寫！

今天，我們?yōu)殚W耀的「星光」加冕——
是你們用專業(yè)鑄就標(biāo)桿，以創(chuàng)新突破邊界；
讓平凡的工作綻放不凡的光芒！

榜樣如炬，照亮前行之路；
下半程的戰(zhàn)鼓已擂響，讓我們繼續(xù)——
與榮耀同行，向巔峰進(jìn)發(fā)！

【預(yù)告篇】
精彩仍在繼續(xù)！明后兩天，我們將：
安吉團(tuán)建之旅：趣味運(yùn)動(dòng)會(huì)+燒烤晚會(huì)
星空夜話：暢想柏恒美好未來

團(tuán)隊(duì)拓展挑戰(zhàn)：勇闖浙北大峽谷

四天的沉淀，一年的能量！

所有蓄力，都是為了更好的迸發(fā)！

2025下半程，柏恒人已整裝待發(fā)！

-END-

[?PCR出現(xiàn)雜帶的處理辦法]

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PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）和凝膠電泳是分子生物學(xué)研究中常用的技術(shù)，它們通常結(jié)合使用以鑒定和分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。然而，在進(jìn)行PCR凝膠電泳時(shí)，經(jīng)常會(huì)在電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)雜帶，這些雜帶可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

本文將探討PCR凝膠電泳過程中雜帶的成因，并提供一些可能的解決方案。

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PCR條件優(yōu)化： 調(diào)整PCR反應(yīng)條件，退火溫度過低會(huì)導(dǎo)致引物與模板的非特異性結(jié)合，從而引發(fā)非特異性擴(kuò)增；退火溫度過高則可能抑制引物與模板的正常結(jié)合，影響擴(kuò)增效率。可以通過梯度PCR實(shí)驗(yàn)逐步確定最佳的退火溫度 一般而言，PCR反應(yīng)的退火步驟的溫度通常在50°C到68°C之間，具體取決于引物的堿基序列和目標(biāo)DNA的特性。有些引物需要更高的退火溫度來確保特定區(qū)域的特異性結(jié)合，但一般情況下，最高退火溫度不會(huì)超過68°C。

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引物設(shè)計(jì)不合理：如果引物長度過短、序列重復(fù)或含有高GC區(qū)域，可能導(dǎo)致引物與模板的非特異性結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生雜帶。需要重新設(shè)計(jì)引物，確保引物的長度適當(dāng)、序列不重復(fù)、GC含量適中，并避免在引物內(nèi)部或引物與模板的結(jié)合區(qū)域出現(xiàn)高GC區(qū)域。

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引物用量不當(dāng)：引物用量過大或特異性不高，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，從而產(chǎn)生雜帶。建議調(diào)換引物或降低引物的使用量。

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模板不純：模板DNA中含有雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、RNA或其他非目標(biāo)DNA片段，可能作為PCR擴(kuò)增的模板，導(dǎo)致額外條帶的出現(xiàn)。

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模板降解：模板DNA在提取或儲(chǔ)存過程中發(fā)生降解，產(chǎn)生的小片段DNA可能成為非特異性擴(kuò)增的模板。

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純化模板DNA：PCR實(shí)驗(yàn)中的模板DNA可以來自多種來源，包括基因組DNA（gDNA）、互補(bǔ)DNA（cDNA）以及質(zhì)粒DNA等。然而，不同來源的DNA在組成和復(fù)雜度上可能有所不同，這會(huì)影響PCR擴(kuò)增的最佳起始量。例如，在50 μL的PCR反應(yīng)中，質(zhì)粒DNA僅需0.1–1 ng，而gDNA則需要5–50 ng。此外，所使用的DNA聚合酶類型也會(huì)對(duì)最佳模板起始量產(chǎn)生影響。經(jīng)過改造的DNA聚合酶對(duì)模板的親和力更強(qiáng)，靈敏度更高，因此所需的DNA起始量相對(duì)較少。優(yōu)化DNA起始量至關(guān)重要，因?yàn)槠鹗剂窟^高可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)增加，而起始量過低則可能降低PCR的得率。有時(shí)，PCR實(shí)驗(yàn)方案會(huì)使用拷貝數(shù)來表示DNA起始量，特別是對(duì)于gDNA。拷貝數(shù)的計(jì)算涉及Avogadro常數(shù)和摩爾質(zhì)量，具體公式為：拷貝數(shù) = L × 摩爾數(shù) = L ×（總質(zhì)量/摩爾質(zhì)量）。

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Mg2?濃度過高：Mg2?是PCR反應(yīng)中的重要成分，但其濃度過高會(huì)降低PCR擴(kuò)增的特異性，增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)。需要通過實(shí)驗(yàn)確定最佳的Mg2?濃度。

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酶的用量或質(zhì)量不佳：酶的用量過高或酶的質(zhì)量不好，都會(huì)影響PCR反應(yīng)。建議降低酶量或更換另一來源的酶。

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使用熱啟動(dòng)PCR： 熱啟動(dòng)PCR可以減少反應(yīng)在低溫度時(shí)可能引起的非特異性擴(kuò)增。

熱啟動(dòng)PCR是一種用于減少非特異性擴(kuò)增的技術(shù)。在常規(guī)PCR中，當(dāng)反應(yīng)溫度升高到擴(kuò)增溫度之前，引物可能已經(jīng)結(jié)合到模板DNA上。這可能導(dǎo)致在PCR開始階段就發(fā)生非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生雜帶或假陽性結(jié)果。熱啟動(dòng)PCR通過在PCR反應(yīng)中添加熱穩(wěn)定的DNA聚合酶來解決這個(gè)問題。

熱啟動(dòng)PCR的關(guān)鍵是使用一種需要高溫激活的聚合酶。這樣的酶在較高溫度下才會(huì)變活躍，因此在反應(yīng)開始時(shí)才會(huì)開始擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列，而不會(huì)在低溫時(shí)引發(fā)非特異性反應(yīng)。

一些常用的熱啟動(dòng)聚合酶包括熱穩(wěn)定的Taq聚合酶的改良版本，例如具有熱活化域的Taq DNA聚合酶，以及Pfu或Phusion等高保真度聚合酶。

所以現(xiàn)在的酶基本上都滿足條件。

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檢查實(shí)驗(yàn)室環(huán)境： 避免DNA污染及實(shí)驗(yàn)儀器的污染，使用無菌技術(shù)和經(jīng)過處理的試劑，保持實(shí)驗(yàn)室清潔。

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梯度優(yōu)化PCR：使用溫度梯度進(jìn)行PCR反應(yīng)，尋找最適合特異性擴(kuò)增的溫度。

柏恒科技智能二維梯度PCR儀可在在同一反應(yīng)中同時(shí)優(yōu)化變性及退火的溫度梯度變性可設(shè)橫向8行變性梯度縱向可設(shè)12列退火溫度，從而來優(yōu)化最佳的退火溫度，從而提高PCR反應(yīng)的特異性和效率。

這個(gè)技術(shù)對(duì)于優(yōu)化引物、模板和PCR條件非常有用，以確保獲得高質(zhì)量和特異性的PCR產(chǎn)物。

這些方法可以單獨(dú)或結(jié)合使用，幫助減少或消除PCR雜帶問題。

在聊壓縮時(shí)長之前，需先對(duì)試管（Tube）/模塊(Block)控溫；普通/快速模式幾個(gè)概念進(jìn)行簡介。下面以柏恒Q9606為圖例進(jìn)行說明。

圖1

模塊控溫：反應(yīng)升降溫時(shí)，以模塊的實(shí)時(shí)溫度為準(zhǔn)。

試管控溫：反應(yīng)升降溫時(shí)，以反應(yīng)管內(nèi)試劑的實(shí)時(shí)溫度為準(zhǔn)。

圖2

圖3

實(shí)驗(yàn)編輯完成后，點(diǎn)擊運(yùn)行按鈕會(huì)彈出提示框（如圖2），選擇快速模式還是普通模式。

以圖3程序?yàn)槔f明：

快速模式：儀器運(yùn)行的升降溫速率為8℃/s，標(biāo)示升降溫速率的全額運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。

普通模式：儀器運(yùn)行的升降溫速率為4℃/s，標(biāo)示升降溫速率的半額運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。

不同的應(yīng)用場(chǎng)景選擇不同的反應(yīng)模式組合，下面來分享一下如何調(diào)試快速試劑的反應(yīng)程序。

首先，儀器運(yùn)行設(shè)置選擇快速模式+模塊控溫的組合將反應(yīng)時(shí)長進(jìn)行極致壓縮。其次，在總時(shí)長不變的前提下合理分配循環(huán)段變性與退火延伸的時(shí)長。最后，在其次篩選出可用反應(yīng)程序的基礎(chǔ)上進(jìn)行微調(diào)，再一次縮短反應(yīng)段的時(shí)長或在總時(shí)長允許的條件下適當(dāng)延長反應(yīng)段的時(shí)長以達(dá)到最優(yōu)的反應(yīng)效果。

因?yàn)榭焖僭噭┧玫臄U(kuò)增酶相較于普通試劑的酶來說有著更為快速的延伸速度，所以在設(shè)置退火延伸段反應(yīng)時(shí)長時(shí)可以進(jìn)行大幅度的壓縮。在壓縮變性反應(yīng)時(shí)長時(shí)須注意，因?yàn)檫x用的是模塊控溫，如果變性時(shí)長過短會(huì)造成試劑的實(shí)際溫度不足95℃或95℃維持時(shí)長不夠而造成模板的解雙鏈不充分進(jìn)而影響信號(hào)的積累，所以變性反應(yīng)段的時(shí)長不宜過度極端。

柏恒Q9600系列可提供最快8℃/sec的升降溫速率，且具備等溫差梯度功能（如圖4），滿足常規(guī)試劑開發(fā)、檢測(cè)的同時(shí)也為快速試劑提供了一個(gè)很好的反應(yīng)平臺(tái)。

圖4

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主要特點(diǎn)：

1.能夠測(cè)量微量樣品的吸光度，通常在納升至微升級(jí)別。

2.高靈敏度和精確度，能夠準(zhǔn)確測(cè)量核酸和蛋白質(zhì)的濃度。

3.通常采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測(cè)量。

4.一般具有緊湊的設(shè)計(jì)和易操作的特點(diǎn)。

工作原理：

核酸和蛋白質(zhì)在紫外-可見光波長范圍內(nèi)具有特定的吸光特性。

通過將樣品放置在光路中，利用光源照射樣品，測(cè)量樣品在特定波長下透射或反射的光強(qiáng)，即吸光度。根據(jù)樣品在特定波長下的吸光度值，結(jié)合已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)ｉT的軟件，可以計(jì)算出核酸或蛋白質(zhì)的濃度。

超微量分光度計(jì)是一種常用的測(cè)定DNA和RNA濃度的方法。

通過測(cè)量特定波長下的光密度（OD值），可以間接計(jì)算出核酸的濃度。

以下是該方法的基本原理和操作步驟：

OD值的含義

OD是optical density的縮寫，表示被檢測(cè)物質(zhì)吸收的光密度。由于核酸中的堿基具有共雙鍵結(jié)構(gòu)，因此它們具有紫外光吸收特性。

不同波長的吸收峰

OD260：DNA雙鏈的吸收峰，主要反映DNA的濃度。
OD280：芳香族氨基酸的吸收峰，主要用于判斷蛋白質(zhì)污染程度。
OD230：核酸提取過程中使用的鹽離子在230nm處有吸收峰，如果OD230很高，說明鹽離子濃度較高。

純度判斷

OD260/OD280的比值用于判斷RNA或DNA的純度。高純度的DNA比值應(yīng)該在1.8-2.0之間。

如果比值低于1.8，說明蛋白質(zhì)污染較嚴(yán)重；高于2.0，則說明可能有RNA污染。

操作步驟

準(zhǔn)備核酸樣品：將待測(cè)的DNA或RNA樣品溶解在適當(dāng)濃度的緩沖液中。
測(cè)量OD值：使用產(chǎn)微量分光光度計(jì)，分別測(cè)量260nm、280nm和230nm處的光密度。
計(jì)算濃度：根據(jù)已知的摩爾消光系數(shù)，計(jì)算DNA或RNA的濃度。

注意事項(xiàng) 
實(shí)驗(yàn)過程中要避免蛋白質(zhì)和鹽離子的污染，否則會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
測(cè)量時(shí)要保持樣品池和空白池的清潔，避免雜質(zhì)干擾。

常見的用途

無論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域 ,還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測(cè)、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門 ,紫外可見分光光度計(jì)督有廣泛而重要的應(yīng)用。分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。

超微量分光光度計(jì)已成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。

核酸的定量

核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。

核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。

如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。

測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。

讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。

純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。

A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

蛋白質(zhì)直接定量

是在280nm波長，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。

蛋白質(zhì)測(cè)定過程非常簡單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測(cè)試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。

實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閃arburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。

蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

OD 600

實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。

OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。

另外，需注意的是，測(cè)試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。