[?PCR出現(xiàn)雜帶的處理辦法]
—— ——
PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）和凝膠電泳是分子生物學(xué)研究中常用的技術(shù)，它們通常結(jié)合使用以鑒定和分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。然而，在進(jìn)行PCR凝膠電泳時(shí)，經(jīng)常會(huì)在電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)雜帶，這些雜帶可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
本文將探討PCR凝膠電泳過(guò)程中雜帶的成因，并提供一些可能的解決方案。
●●●
PCR條件優(yōu)化： 調(diào)整PCR反應(yīng)條件，退火溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致引物與模板的非特異性結(jié)合，從而引發(fā)非特異性擴(kuò)增；退火溫度過(guò)高則可能抑制引物與模板的正常結(jié)合，影響擴(kuò)增效率。可以通過(guò)梯度PCR實(shí)驗(yàn)逐步確定最佳的退火溫度 一般而言，PCR反應(yīng)的退火步驟的溫度通常在50°C到68°C之間，具體取決于引物的堿基序列和目標(biāo)DNA的特性。有些引物需要更高的退火溫度來(lái)確保特定區(qū)域的特異性結(jié)合，但一般情況下，最高退火溫度不會(huì)超過(guò)68°C。
●●●
引物設(shè)計(jì)不合理：如果引物長(zhǎng)度過(guò)短、序列重復(fù)或含有高GC區(qū)域，可能導(dǎo)致引物與模板的非特異性結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生雜帶。需要重新設(shè)計(jì)引物，確保引物的長(zhǎng)度適當(dāng)、序列不重復(fù)、GC含量適中，并避免在引物內(nèi)部或引物與模板的結(jié)合區(qū)域出現(xiàn)高GC區(qū)域。
●●●
引物用量不當(dāng)：引物用量過(guò)大或特異性不高，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，從而產(chǎn)生雜帶。建議調(diào)換引物或降低引物的使用量。
●●●
模板不純：模板DNA中含有雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、RNA或其他非目標(biāo)DNA片段，可能作為PCR擴(kuò)增的模板，導(dǎo)致額外條帶的出現(xiàn)。
●●●
模板降解：模板DNA在提取或儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生降解，產(chǎn)生的小片段DNA可能成為非特異性擴(kuò)增的模板。
●●●
純化模板DNA：PCR實(shí)驗(yàn)中的模板DNA可以來(lái)自多種來(lái)源，包括基因組DNA（gDNA）、互補(bǔ)DNA（cDNA）以及質(zhì)粒DNA等。然而，不同來(lái)源的DNA在組成和復(fù)雜度上可能有所不同，這會(huì)影響PCR擴(kuò)增的最佳起始量。例如，在50 μL的PCR反應(yīng)中，質(zhì)粒DNA僅需0.1–1 ng，而gDNA則需要5–50 ng。此外，所使用的DNA聚合酶類(lèi)型也會(huì)對(duì)最佳模板起始量產(chǎn)生影響。經(jīng)過(guò)改造的DNA聚合酶對(duì)模板的親和力更強(qiáng)，靈敏度更高，因此所需的DNA起始量相對(duì)較少。優(yōu)化DNA起始量至關(guān)重要，因?yàn)槠鹗剂窟^(guò)高可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)增加，而起始量過(guò)低則可能降低PCR的得率。有時(shí)，PCR實(shí)驗(yàn)方案會(huì)使用拷貝數(shù)來(lái)表示DNA起始量，特別是對(duì)于gDNA。拷貝數(shù)的計(jì)算涉及Avogadro常數(shù)和摩爾質(zhì)量，具體公式為：拷貝數(shù) = L × 摩爾數(shù) = L ×（總質(zhì)量/摩爾質(zhì)量）。
●●●
Mg2?濃度過(guò)高：Mg2?是PCR反應(yīng)中的重要成分，但其濃度過(guò)高會(huì)降低PCR擴(kuò)增的特異性，增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)。需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最佳的Mg2?濃度。
●●●
酶的用量或質(zhì)量不佳：酶的用量過(guò)高或酶的質(zhì)量不好，都會(huì)影響PCR反應(yīng)。建議降低酶量或更換另一來(lái)源的酶。
●●●
使用熱啟動(dòng)PCR： 熱啟動(dòng)PCR可以減少反應(yīng)在低溫度時(shí)可能引起的非特異性擴(kuò)增。
熱啟動(dòng)PCR是一種用于減少非特異性擴(kuò)增的技術(shù)。在常規(guī)PCR中，當(dāng)反應(yīng)溫度升高到擴(kuò)增溫度之前，引物可能已經(jīng)結(jié)合到模板DNA上。這可能導(dǎo)致在PCR開(kāi)始階段就發(fā)生非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生雜帶或假陽(yáng)性結(jié)果。熱啟動(dòng)PCR通過(guò)在PCR反應(yīng)中添加熱穩(wěn)定的DNA聚合酶來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。
熱啟動(dòng)PCR的關(guān)鍵是使用一種需要高溫激活的聚合酶。這樣的酶在較高溫度下才會(huì)變活躍，因此在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)才會(huì)開(kāi)始擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列，而不會(huì)在低溫時(shí)引發(fā)非特異性反應(yīng)。
一些常用的熱啟動(dòng)聚合酶包括熱穩(wěn)定的Taq聚合酶的改良版本，例如具有熱活化域的Taq DNA聚合酶，以及Pfu或Phusion等高保真度聚合酶。
所以現(xiàn)在的酶基本上都滿(mǎn)足條件。
●●●
檢查實(shí)驗(yàn)室環(huán)境： 避免DNA污染及實(shí)驗(yàn)儀器的污染，使用無(wú)菌技術(shù)和經(jīng)過(guò)處理的試劑，保持實(shí)驗(yàn)室清潔。
●●●
梯度優(yōu)化PCR：使用溫度梯度進(jìn)行PCR反應(yīng)，尋找最適合特異性擴(kuò)增的溫度。
柏恒科技智能二維梯度PCR儀可在在同一反應(yīng)中同時(shí)優(yōu)化變性及退火的溫度梯度變性可設(shè)橫向8行變性梯度縱向可設(shè)12列退火溫度，從而來(lái)優(yōu)化最佳的退火溫度，從而提高PCR反應(yīng)的特異性和效率。
這個(gè)技術(shù)對(duì)于優(yōu)化引物、模板和PCR條件非常有用，以確保獲得高質(zhì)量和特異性的PCR產(chǎn)物。
這些方法可以單獨(dú)或結(jié)合使用，幫助減少或消除PCR雜帶問(wèn)題。
